HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC SAPONIN TRONG SÂM NGỌC LINH

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SAPONIN TRONG SÂM NGỌC LINH - SÂM VIỆT NAM,

PANAX VIETNAMENSIS HÀ ET GRUSHV

Kazuo Yamasaki

Viện Khoa học Dược, khoa Y, đại học Hiroshima, Nhật Bản.

Công bố trực tuyến: 10/01/2011

Vinaginseng Pharma dịch.

Tóm tắt:

Sâm Ngọc Linh - Nhân sâm Việt Nam – viết tắt là VG (tên khoa học là: Panax Vietnamensis Hà et grushV) gần đây được tìm thấy ở miền trung Việt Nam là một loài cây mới. Nó được sử dụng trong y học cổ truyền của các dân tộc miền núi với mục đích chống mệt mỏi và cứu nghịch. Từ thân rễ và rễ của cây này, 7 saponin bao gồm 14 hợp chất mới được phân lập. Một vài chất cũng có trong các loài Panax khác nhưng hàm lượng ở sâm Việt Nam lại đặc biệt cao. Đáng chú ý là saponin lại ocotillol Majornoside-R2 (MR2) chiếm 5,3%. Đặc điểm cấu trúc của các saponin mới đã được tìm ra. Còn tác dụng sinh học của các saponin này được nghiên cứu trên hai phương diện, chống stress và tác dụng chống khối u; cả hai tác dụng đều dựa trên cách sử dụng cổ truyền của loại thuốc này. Ở chuột bị stress, thành phần saponin của sâm Việt Nam làm giảm rõ rệt các rối loạn liên quan đến stress (stress gây giảm thời gian ngủ, hình thành các vết loét dạ dày) và MR2 là hợp chất mang lại tác dụng này. Một cơ chế khả thi cho tác dụng này đã được đề xuất. MR2 thể hiện khả năng ngăn chặn đáng kể kháng nguyên sớm của virus Epstein-Barr (EBVEA) gây ra bởi chất thúc đẩy khối u phorbol acetate. MR2 cũng cho thấy tác dụng chống ung thư mạnh mẽ trên da và gan chuột.

Giới thiệu:

Nhân sâm Việt Nam được tìm thấy ở vùng núi cao của miền Trung Việt Nam vào năm 1973, và là một loài cây mới với tên gọi khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv. (Dung et al., 1985). Đây là vùng phân bố xa nhất ở phía nam của chi Panax (Araliaceae). Nó là một loại thuốc bí mật của đồng bào dân tộc Xê Đăng, được sử dụng như một loại cây thuốc thần kỳ, cứu sống mạng người, chữa nhiều bệnh hiểm nghèo, tăng khả năng thích nghi và nâng cao thể lực trong những chuyến đi xa trên núi cao (Nham, 1989).

Việc phát hiện loài cây mới đã dẫn đến việc thành lập Trung Tâm Sâm & Dược Liệu tại thành phố Hồ Chí Minh. Ở đây, một nghiên cứu toàn diện về cách trồng, thành phần hoá học và tác dụng dược lý của nhân sâm Việt Nam đang được thực hiện với sự hợp tác của một số trường đại học Nhật Bản. Bài báo cáo này nghiên cứu cấu trúc của các saponin và một số tác dụng sinh học là kết quả từ việc hợp tác của chúng tôi.

Phân lập và cấu trúc các saponin:

Các nguyên liệu thảo dược được thu thập ở độ cao 1500 - 2500 m ở miền Trung Việt Nam vào mua thu năm 1978. Do không có sự khác biệt đáng kể về thành phần saponin của thân rễ và rễ đã được kiểm chứng trong thí nghiệm sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng, cả hai bộ phận được trộn với nhau và chiết bằng MeOH nóng, MeOH 50% nóng. Dịch chiết hỗn hợp được chạy trên cột sắc ký polyme có độ xốp cao, Diaion HP-20 (Misubishi Chem. Idn.). Sử dụng nước, MeOH, CHCl3 làm dung môi rửa giải. Dịch rửa giải MeOH (saponin thô) chạy sắc ký cột (CC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để thu được daucosterin (sitosteryl glucoside), 23 saponin đã biết và 14 saponin dammarane mới, đặt tên là vina-ginsenosides-R1 – R14 (Đức cùng các cộng sự., 1993, 1994a, 1994b).

Xác định các saponin đã biết:

Mỗi saponin được xác định bằng cách so sánh kết quả chạy TLC, góc quay cực, ¹H và ¹³C. Phổ NMR và EIMS dưới dạng ete trimetylsilyl với phổ của một mẫu đã xác thực tương ứng hoặc dữ liệu đã được báo cáo. Các hợp chất đã được xác định là tám loại protopanaxadiol (2) saponin (3-10), bảy loại protopanaxatriol (12) saponin (13-19), bốn loại saponin loại ocotillol (21) saponin (22-25) và hai axit oleanolic (26) saponin (27-28) được liệt kê trong hình 1-4 cùng với hàm lượng.

Hầu hết các saponin đã được phân lập từ các loài  Panax khác, mặc dù gypenoside XVII (8) (Takemoto cùng các cộng sự., 1983) và hemsloside Ma3 (28) (Nie cùng các cộng sự., 1984) trước đây không được phân lập từ Araliaceae mà từ Cucurbitaceous. Sản lượng gínenosides-Rb1 (3) và –Rg1 (15) cao hơn sản lượng của rễ Panax ginseng C. A. Meyer. Hàm lượng cao của saponin ocotillol, Majornoside-R2 (25, 5.3%), rất đáng chú ý. Saponin này trước đây đã được phân lập từ Panax japonicus C. A. Meyer  var. major (Burk) C.Y. Wu et K. M. Feng gốc Trung Quốc (Morita cùng các cộng sự., 1982), nhưng hàm lượng rất nhỏ (< 0.1%).

Xác định cấu trúc của những Saponin mới, Vinaginsengoside R1-R14:

Các cấu trúc hoá học của saponin mới, vinaginsengnoside R1-R14, đã được làm sáng tỏ qua các phương pháp hoá học và quang phổ, đặc biệt là MS, và một số phương thức đó NMR rất hữu ích. Chỉ những đặc điểm và các cấu trúc đặc trưng được mô tả.

Vinaginoside R1 và R2 (30)  là saponin ocotillol có nhóm acetyl trên mạch đường ở C-6 (Đức và các cộng sự, 1993). Vị trí acetyl hoá được xác định bằng EI-MS trong các dẫn chất TMS và quy tắc chuyển dịch acetyl hoá của ¹³C NMR (Yamasaki cùng các cộng sự., 1977).

Vina-ginsenoside R3 (31) là chất duy nhất thiếu OH ở vị trí C-12 trong tất cả các saponin phân lập từ loài này. Enzyme thuỷ phân rất hữu ích để xác định aglycon dammarenediol II của sâm Việt Nam. Vinaginsenoside R4 (32) là ví dụ đầu tiên về một protopanaxatriol saponin có liên kết glycosyl tại C-3. Quy tắc chuyển dịch glycosyl hoá (Kasai và các cộng sự, 1997) được sử dụng để xác định vị trí liên kết glycosyl.

Vina-ginsenoside R5 (33) và R6 (34) là những ví dụ hiếm hoi về saponin có gốc –glucosyl. Hằng số ghép nối (giá trị J) của các proton anomeric rất quan trọng để đánh giá liên kết anomeric.

Vina-ginsenoside R7 (35) xylosyl ginsenoside Rd. Vị trí gốc xylosyl được xác định bằng MS và bằng cách so sánh ¹³C NMR với một hợp chất đã biết có cùng mạch nhánh.

Hình 1. Các saponin loai protopanaxadiol được phân lập từ Panax vietnamensis, trước đây được biết đến trong các loài cây khác nhau.

Hình 2. Các saponin loại protopanaxatriol được phân lập từ Panax vietnamensis, trước đây được biết đến trong các loài cây khác nhau.

Hình 3. Các saponin loại ocotillol được phân lập từ Panax vietnamensis, trước đây được biết đến trong các loài cây khác nhau.

Hình 4. Các saponin loại oleanolic acid được phân lập từ Panax vietnamensis, trước đây được biết đến trong các loài cây khác nhau.

Vina-ginsenoside R8 (36) có mạch nhánh với một liên kết đôi di chuyển từ C-25 có nhóm OH. Cấu trúc đã được xác nhận qua so sánh ¹³C NMR của một hợp chất tương tự, Majornoside F4 (37, cấu trúc không được minh hoạ), là 3-O- và 20-O-di β-d-glucoside trên cùng một aglycone (Feng et al., 1987).

Vina-ginsenoside R9 (38) cũng có mạch nhánh có liên kết đôi di chuyển như (36), cấu trúc được xác định thông qua so sánh với ¹³C NMR của majornoside-F1, 24-spimer (Feng et al., 1987). Sự khác biệt ở giá trị δ do sự không trùng vật ảnh ở vị trí C-24. Quá trình oxy hoá cảm quang của ginsenoside Rd (7) tạo ra ba sản phẩm 36,38 và 24 epimer. Phản ứng này không chỉ xác nhận cấu trúc của vina-ginsenoside R8 và R9, mà còn hàm ý về sự hình thành sinh học của các saponin này (Đức et al., 1994a).

Vina-ginsenoside R10 (39) và R11 (40) là các saponin tương tự có vòng pyran trong nhánh giống panaxadiol (sản phẩm thuỷ phân trong môi trường acid của saponin protopanaxadiol). Hoá học lập thể của nhánh được tiết lộ bởi NOE và HMBC trong NMR, cũng như phản ứng oxy hoa Jones.

Vinaginsenoside R12 (43) và R13(44) trong mạch nhánh có diol. EL-MS và HMBC rất hữu ích để xác định cấu trúc mạch nhánh. Để xác định liên kết đường của 43, kỹ thuật ¹H - ¹H COST và NOESY  đã được sử dụng hiệu quả.

Vinaginsenoside R14 (45) là một saponin ocotillol và aglycon liên quan chặt với (20S)-protopanaxatriol oxide II. Bằng cách quan sát chi tiết NMR 13C, người ta đã suy ra sự gắn OH ở 26-C. Các thí nghiệm NOE đã tiết lộ hoá lập thể (Đức và các cộng sự., 1994b). Cấu trúc của những saponin mới được phân lập từ Panax vietnamensis được tóm tắt trong hình 5.

Hoạt tính sinh học:

Tác dụng chống ung thư:

Để tìm kiếm các chất chống ung thư có thể có (tác nhân ngăn ngừa ung thư), ta sàng lọc các chất chiết từ thảo dược bằng cách đánh giá tác dụng ức chế sự hoạt hoá kháng nguyên sớm của virus Epstein-Barr (EBV-EA) do 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) gây ra (Konoshima và các cộng sự, 1998). Chiết xuất methanol của Panax vietnamensis cho thấy tác dụng ức chế đáng kể (37.9% ở 100 µg/ml). Vì hoạt tính tập trung ở phần saponin, nên các saponin chính của của sâm Việt Nam đã được thử nghiệm, tức là các loại saponin protopanaxadiol: ginsenoside-Rb1 (3, 2.0%), -Rd(7, 0.87%); saponin protopanaxatriol: ginsenoside-Re (13, 0.17%) và ginsenoside-Rg1 (1, 1.37%); và saponin loại ocotillol: majornoside R1 (24, 0.14%) và majornoside R2 (MR2, 25, 5.3%). Trong số đó, saponin chính, MR2, thế hiện tác dụng ức chế mạnh nhất đố với sự hoạt hoá EBVEA (50% ở tỷ lệ 100 mol/TPA), được trình bày trong hình 6. Hoạt tính này cao hơn nhiều so với acid glycyrrhetic (Mitzutani, 1994) được biết đến là một chất chống ung thư mạnh.

                     Hình 5. Các saponin mới được phân lập từ Panax vietnamensis (Duc et al., 1993, 1994a, 1994b).

Hình 6. Ức chế cảm ứng EBV-EA bằng saponin phân lập từ Panax vietnamensis (Konoshima và các cộng sự, 1998). Giá trị thể hiện phần trăm so với giá trị kiếm soát dương tính (n = 3), TPA = 32 pmol (20 ng/ml).

Tác dụng của MR2 đến chu kỳ tế bào của tế bào Raji được dùng TPA đã được kiểm tra bằng kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy. Bằng cách điều trị với MR2, tỷ lệ pha S của tế bào Raji được tăng lên, nhưng tỷ lệ pha G₂+M bị giảm theo liều lượng. Cho thấy cơ chế ức chế của MR2 đối với ung thư do TPA là thông qua ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào.

Trên cơ sở của thí nghiệm in vitro ở trên, một thí nghiệm in vivo đã được thực hiện. Tác dụng ức chế của MR2 đối với thí nghiệm sinh ung thư hai giai đoạn trên khối u da chuột được đánh giá bằng cách sử dụng 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) như một chất khơi mào, và TPA như một chất thúc đẩy. Sự sản sinh u nhú do TPA kích thích đã giảm đáng kể và bị trì hoãn với việc điều trị dự phòng 85 nmol MR2 (Hình 7). Hoạt tính của MR2 cao hơn hoạt tính của acid glycyrrhetic (Tokuda, et al. 1986). Khả năng ức chế của MR2 thể hiện với tác nhân khác ngoài TPA như fumonsin B1 (Konoshima và các cộng sự, 1998).

MR2 cũng thể hiện khả năng chống ung thư mạnh mẽ trong một thí nghiệm sinh ung thư hai giai đoạn trên khối u gan chuột bằng cách sử dụng N-nitrosodiethylamin (DEN) như một chất khởi đầu và phenobarbital (PB) như một chất thúc đẩy (Bảng 1). Hơn nữa MR2 thể hiện tác dụng ức chế đáng kể đối với thử nghiệm sinh ung thư hai giai đoạn trên da chuột do nitric oxide (NO)/TPA hoặc peroxynitrite/TPA gân ra (Konoshima et al., 1999).

Tác dụng chống stress:

Sâm Việt Nam được biết đến là có tác dụng chống mệt mỏi và tác dụng của một adaptogen. (Nham et al., 1995). Khái niệm về một adaptogen là một khái niệm mơ hồ nhưng nó được công nhận là phương pháp dự phòng giúp tái lập cân bằng nội môi bằng cách tăng sức đề kháng chung, chống lại căng thẳng về tinh thần, thể chất và hoá chất.

Chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng của nhân sâm Việt Nam (VG) và saponin chính của nó, Majornoside-R2 (MR2, 25), đối với các phản ứng hành vi và sinh lý bệnh gây ra bởi căng thẳng tâm lý ở chuột và làm sáng tỏ tác dụng của VG thông qua các cơ chế thần kinh có thể có (Huong et al., 1995). Đối với những con chuột bị căng thẳng tâm lý, phương pháp the communication box (Ogawa et al., 1990) được sử dụng. Đặc điểm quan trọng của phương pháp này là một con vật tiếp xúc với căng thẳng về thể chất, chẳng hạn như bị gây sốc ở chân bằng điện có thể gây căng thẳng tâm lý xã hội ở động vật bằng cách sử dụng giao tiếp cảm xúc trong loài. Ngưỡng cảm thụ được ước tính bằng phương pháp kẹp đuôi. Các tổn thương dạ dày được đánh giá sau khi cho chuột tiếp xúc với căng thẳng trong 16h (Huong et al. 1996c). Sau khi dùng pentobarbital, thời gian mất phản xạ chính xác của chuột được đo bằng thời gian ngủ (50 mg/kg, tiêm phúc mạc).

Hình 7. Ức chế ung thư do TPA gây ra sau khi sử dụng nhiều lần Majornoside-R2 (25) và acid glycyrrhetic (Knoshima et al., 1998). Tất cả chuột được bắt đầu với DMBA (390 nmol) và được thúc đẩy bằng TPA (1.7 nmol) hai lần mỗi tuần bắt đầu từ 1 tuần sau khi bắt đầu. Đối chứng tích cực: chỉ dùng TPA, nồng dộ acid glycyrrhetic và MR2 là 85 nmol.

Bảng 1. Tỷ lệ tăng sản ở gan trên chuột được điều trị bằng MR2 (25) (Konoshima et al., 1999):

^aMười lăm con chuột trong mỗi nhóm, không có sự khác biệt đáng kể về trọng lượng cơ thể giữa các nhóm.

^bPB, 0.9% of phenobarbital, tổng liều là 44.8 mg/ con/ tuần

^cDEN, N-nitrosodiethylamine (0.9 mg mỗi con, tiêm phúc mạc).

^dMR2, 0.0025% of majonoside R2 (25).

Điều trị dự phòng với dịch chiết VG (100 mg/kg, p.o.) hoặc VG saponin (6.25-25 mg/kg, p.o.) đã ngăn chặn quá trình mất cảm giác đau do căng thẳng gây ra. MR2 (3.1 – 12.5 mg/kg) cũng làm giảm hiệu ứng mất cảm giác đau do căng thẳng gây ra. Cả flumazenil và picrotoxin đều ngăn chặn hoàn toàn tác dụng đối kháng của MR2 với tác dụng giảm đau của opioid. Có khả năng MR2 ngăn chặn quá trình mất nhạy cảm đau do căng thẳng thông qua việc điều chỉnh hoạt động của hệ thống opioid (Huong et al., 1996a, 1996b, 1997a). Điều tri dự phòng với dịch chiết VG, MR2 (6.2 và 12.5 mg/kg, p.o.), diazepam hoặc nalozoxone thể hiện tác dụng bảo vệ dạ dày khỏi các tổn thương do stress gây ra, trong dịch chiết sâm Hàn Quốc (50 mg/kg, p.o.) không ngăn chặn được các tổn thương dạ dày (Bảng 2). Stress làm giảm tác dụng an thần của pentobarbital. Dịch chiết VG (50 mg/kg, p.o.), VG saponin (25 mg/kg, p.o.) và MR2 (3.1-12.5 mg/kg, p.o.) đều khôi phục tác dụng an thần của pentobarbital ở mức độ chuột đối chứng không bị stress. (Bảng 3). Dịch chiết sâm Hàn Quốc (50 -100 mg/kg, p.o.) không có sự thay đổi nào tới tác dụng an thần của pentobarbital ở cả chuột bị stress và chuột đối chứng. Tác dụng đối chiếu được gây ra bởi numazenil. Những kết quả này cho thấy phức hợp thụ thể GABA benzodiazepine tham vào tác động của MR2 đối vợi sự giảm căng thẳng trong giấc ngủ có pentobarbital (Huong et al., 1996c).

Ngoài sử dụng phương pháp the communication box để gây stress, stress từ cô lập xã hội do sống riêng lẻ cũng làm giảm tác dụng an giấc của pentobarbital và MR2 làm giảm đáng kể hiệu ứng này. Đáp ứng được thực hiện ở tế bào thần kinh trên phức hợp thụ thể GABA ở chuột. (Huong et al., 1997b).

Bảng 2. Ảnh hưởng của dịch chiết VG, VG-Saponin và Majornoside-R2 (MR2) đối với việc giảm stress trong giấc ngủ nhờ pentobarbital ở chuột (Huong et al., 1996c).

* P < 0.01 so sánh với mẫu trắng

Những con chuột được chia thành hai nhóm và nhóm căng thẳng được tiếp xúc với căng thẳng tâm lý trong 30 phút. Các loại thuốc thử nghiệm được sử dụng vào khoảng 1 giờ trước khi tiếp xúc với căng thẳng. Mỗi dữ liệu tương ứng với S.E.M trung bình của 12-15 con chuột.

Bảng 3. Tác dụng bảo vệ của dịch chiết nhân sâm Việt Nam (VG) và Majornoside-R2 chống lại các tổn thương dạ dày do căng thẳng tâm lý (Huong et al., 1996c)

Những con chuột được chia thành 2 nhóm, và nhóm căng thẳng được tiếp xúc với căng thẳng tâm lý trong 16 giờ. Tỷ lệ tổn thương dạ dày được biểu thị bằng tỷ số giữa số động vật có điểm tổn thương là 2 trên số động vật được sử dụng. Mức độ nghiêm trọng của tổn thương được biểu thị bằng điểm trung bình ± SEM của 12-14 con chuột. Thuốc thử (ngoại trừ naloxone) đã được sử dụng p.o. 1 giờ trước khi tiếp xúc với căng thẳng. Naloxone đã được tiêm i.p. 10 phút trước khi tiếp xúc với căng thẳng. *P< 0.05, **P<0.01 so với điều trị bằng dung môi.

Thông qua nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khả năng rất lớn MR2 là chất tạo ra tác dụng đặc trưng ở thuốc dạng thô. Đáng chú ý là MR2 không ảnh hưởng đến thời gian ngủ của pentobarbital ở nhóm đối chứng không stress, trong khi diazepam (một thuốc an thần nhẹ) kèo dài thời gian ngủ của pentobarbital ở chuột không bị stress và bị stress.

Các nghiên cứu này cung cấp bằng chứng về tác dụng chống stress của cây sâm Việt Nam, đặc biệt đối với các rối loạn tâm thần do căng thẳng tâm lý cũng như vai trò quan trọng của MR2 đối với tác dụng của loại cây thuốc này.

Majornoside-R2 (25) không chỉ có hàm lượng lớn trong sâm Việt Nam mà còn có vai trò quan trọng trong cả hoạt tính sinh học. Về mặt hoá học, ocotillol có thể thu được bằng cách epoxy hoá peracid của dẫn xuất dammarene tương ứng với một nhánh tuyến tính (Hình 8). Trong phản ứng này, epoxide trung gian không bền có thể bị cô lập và nó tạo ra hỗn hợp 24R và S. Trong nhân sâm Việt Nam, chỉ phân lập dược saponin 24S và không phân lập được tiền chất có thể có là notoginsenoside-R2 (46) mà chỉ phân lập được lượng tương ứng 20 β-glucoside, notoginsenoside-R1(18) tương ứng. Nghiên cứu sinh hoá và chuyển hoá của MR2 đang được tiến hành trong phòng thí nghiệm của chúng tôi.

Hình 8. Sự hình thành saponin ocotillol

Lời cám ơn

Khảo sát này là kết quả nghiên cứu hợp tác quốc tế của chúng tôi với Tiến sĩ N. T. Nhâm, nguyên giám đốc của Trung tâm Sâm và Dược liệu, Dr. N. M. Duc thuộc Đại học thành phố HCM, Dr. N. T. T. Hương của Trung tâm Sâm và Dược liệu, Giáo sư danh dự O. Tanaka và Tiến sĩ R. Kasai của Đại học Hiroshima, Tiến sĩ T. Konoshima và Tiến sĩ M. Takasaki của Đại học Dược Kyoto, Giáo sư H. Watanabe và Tiến sĩ K. Matsumoto của ĐH Y Dược Toyama, chúng tôi chân thành cám ơn quý vị.

-------------------------------

Xem thêm bài viết:

Tác dụng sâm ngọc linh tại đây: https://vinapanax.vn/blogs/news/cong-dung-sam-ngoc-linh

Bảng giá sâm ngọc linh Vinapanax tại đây: https://vinapanax.vn/blogs/news/gia-ban-sam-ngoc-linh

Tìm hiểu sản phẩm từ sâm ngọc linh tại đây: https://vinapanax.vn/blogs/news/tim-hieu-ve-sam-ngoc-linh

Dùng sâm ngọc linh như thế nào tại đây: https://vinapanax.vn/blogs/news/cach-dung-sam-ngoc-linh-nhu-the-nao

Sâm ngọc linh có tốt không tại đây: https://vinapanax.vn/blogs/news/sam-ngoc-linh-co-tot-khong

Sâm ngọc linh gồm những thành phần gì tại đây: https://vinapanax.vn/blogs/news/sam-ngoc-linh-la-sam-gi